Genetika úvod
S rozvojem poznatků o genetickém pozadí různých chorob, včetně poruch reprodukce, dochází ke stále užšímu propojení lékařské genetiky a reprodukční medicíny s asistovanou reprodukcí a embryologií. Vzniklo tak nové odvětví lékařské genetiky - reprodukční genetika, která se specializuje na zdokonalení prekoncepční, preimplantační a klasické prenatální diagnostiky geneticky podmíněných patologických stavů použitím metod klasické a molekulární cytogenetiky a molekulární genetiky. Ve spojení se specializovaným genetickým poradenstvím se reprodukční genetika zaměřuje na poskytnutí komplexní léčebně-preventivní péče o manželský/ partnerský pár s poruchami reprodukce.
Metody asistované reprodukce umožňují dosáhnout gravidity a naplnit představu o kompletní rodině i v těch případech, kdy selhává přirozená cesta reprodukce. Přitom sterilita a reprodukční ztráty představují důležitý selekční mechanizmus. Je známo, že kromě gynekologických, andrologických, hormonálních či imunologických faktorů se na etiologii infertility podílejí také genetické faktory - monogenní (defekt v jednom genu), chromozomální i multifaktoriální (společné působení více genů a současně faktorů prostředí). Předpokládá se, že geneticky podmíněné bariéry včetně chromozomálních anomálií a mutací genů jsou přítomny u 15% mužů a u 10% žen s poruchami plodnosti. Některé genetické faktory - např. chromozomální aberace a mutace některých genů jsou známy již řadu let, v případě dalších se uvažuje o jejich vazbě na specifickou oblast chromozomu, ale většina z nich zůstává stále neodhalena. Překlenutí genetických bariér moderními metodami asistované reprodukce může znamenat přenos geneticky podmíněné sterility (mikrodelece na pohlavním chromozomu Y), některých onemocnění (např. cystické fibrózy, sklonu k trombózám aj.) a syndromů (chromozómové anomálie) na potomstvo.
Po několikaletém úsilí se Sanatoriu Pronatal podařilo dosáhnout smlouvy
s pojišťovnami na výkony lékařské genetiky, včetně laboratorních vyšetření, čímž se
optimálně doplnila diagnostická a léčebná péče o neplodná páry bezprostředně dostupným
oddělením lékařské genetiky. Naše oddělení lékařské genetiky zahájilo činnost 1. 10. 2002
jako specializované pracoviště poskytující služby v oblasti genetického poradenství a
laboratorních vyšetření pro naše pacienty. Na základě úvodní genetické konzultace vedené
lékařským genetikem s infertilním manželským párem, jejíž součástí je i genealogická analýza,
realizujeme cytogenetické vyšetření, na které navazuje DNA diagnostika mutací v genu CFTR pro
cystickou fibrózu, Leidenské mutace v genu F5 pro plazmatický faktor FV a mutace G20210A v
genu kódujícím protrombin (sklon k trombózám, spontánním potratům a gynekologickým komplikacím)
a mikrodelecí (drobných ztrát) na chromozómu Y (snížená plodnost až neplodnost mužů).
Na základě výsledků cytogenetického a molekulárně genetického vyšetření je pár před
IVF obeznámen s riziky pro potomky a zajištěna je cílená preimplantační a nebo
prenatální genetická diagnostika. Do rutinní praxe jsme již zavedli preimplantační
diagnostiku chromozomálních anomálií metodou FISH v časných stadiích embryí před
jejich přenosem do dělohy (obr. 1).
(obr. 1) Rizikový pár - Schéma genetického vyšetření páru s poruchami reprodukce a preimplantační genetická diagnostika (PGD) v Sanatoriu Pronatal
Samozřejmostí je i genetické vyšetření dárců pohlavních buněk (genetická konzultace, cytogenetické vyšetření a vyšetření mutací v CFTR genu pro cystickou fibrózu).
Současně pracujeme na zdokonalování metodických postupů s cílem rozšířit paletu vyšetření na defekty dalších genů podmiňujících sterilitu pro některé specifické skupiny pacientů, na rozšíření preimplantační genetické diagnostiky o vyšetření karyotypu z jedné embryonální buňky, určení frekvence geneticky patologických spermií metodou FISH u těžkých poruch spermatogeneze a cytogenetického vyšetření spontánních potratů po léčbě infertility metodami asistované reprodukce.
DNA a chromozomy člověka
Genetická informace člověka je uložena v kyselině deoxyribonukleové (DNA). Jde o specifický druh biomakromolekuly schopné uchovávat informace o vlastnostech a znacích člověka. Úseky DNA reprezentují konkrétní geny, přičemž každý gen má své přesně vymezené, specifické místo v DNA (lokus) .
DNA je přítomna především v jádrech buněk (genomová DNA). Pouze její malá část je uložena v malých buněčných organelách - mitochondriích (mitochondriální DNA), které se vyskytují v cytoplazmě buňky. Genomová DNA je přítomná ve všech buňkách majících jádro, s výjimkou zralých červených krvinek – erytrocytů, což má praktický význam pro odběr biologického materiálu na genetické vyšetření.
DNA spolu s komplexy bílkovin, RNA, iontů a enzymů tvoří chromatin. Mnohonásobným zkracováním chromatinových vláken vznikají malé struktury – chromozomy. Pokud chromatin obsahuje aktivní geny, mluvíme o euchromatinu. Některé části chromosomů jsou však tvořeny tzv. heterochromatinem, který obsahuje neaktivní geny. Heterochromatin se svými funkčními a barvícími vlastnostmi odlišuje od geneticky aktivního euchromatinu.
Normální, zdravý lidský jedinec má v somatických buňkách (tj. v tělních buňkách) 46 chromozomů. Z nich 22 párů, tedy 44 chromozomů, jsou tzv. autozomy a 2 chromozomy reprezentují pohlavní chromozomy – gonozomy. Zatímco žena má 2 pohlavní chromozomy XX, muž disponuje pohlavními chromozomy X a Y. To znamená, že fyziologický ženský karyotyp je 46,XX (obr. 2) a fyziologický mužský karyotyp je 46,XY (obr. 3). Sada 46 chromozomů v somatické buňce se označuje jako diplodní.
(obr. 2) Ženský karyotyp 46, XX
(obr. 3) Mužský karyotyp 46, XX
Při dělení buněk se chromozomy, a tedy i genetická informace v nich obsažená, přesně rozdělí do nově vznikajících dceřinných buněk. Ve zralých pohlavních buňkách je tak přítomná jen poloviční sada, tj.23 chromozomů, která se označuje jako haploidní. Všechna normální, zralá vajíčka ženy nesou jeden pohlavní chromozóm X, zralé spermie muže obsahují buď chromozom X nebo chromozom Y. Protože somatické (tělní) buňky člověka obsahují chromozomy v párech – muži jsou výjimkou – každý gen je přítomen ve dvou různých formách, které se nazývají alely. Obě dvě alely mohou být normální, případně mutované (poškozené) nebo je jedna alela normální a druhá mutovaná. V pohlavních buňkách je přítomen jen jeden chromozom z každého páru, který nese jen jednu alelu – normální nebo mutovanou.
Na chromozomu je možné rozlišit několik částí (obr. 4). Každý chromozom má jednu zužující se oblast – primární konstrikci, kde se nachází centromera. Centromera hraje významnou úlohu během buněčného dělení při rozdělování chromozomů do dceřinných buněk. Centromera dělí chromozóm na 2 části – krátké rameno (označované p) a dlouhé rameno (označované q). Konce obou ramen chromozomu se nazývají telomery. Akrocentrické chromozomy č. 13, 14, 15, 21 a 22 obsahují kromě centromery oblast sekundární konstrikce, kterou se odděluje od jejich krátkého ramena maličká část – satelit. Spojení mezi krátkým ramenem a satelitem zabezpečuje tenký můstek. Je to místo, kde se organizuje jadérko.
(obr. 4) Morfologie chromozomu
Rozdělení chromozomů na jednotlivé části je důležité pro přesný popis chromozomu a změn, které na něm nastávají.
Chromozomy se vzájemně liší velikostí, postavením centromery a proužkováním, které se na nich vytvoří při použití různých barvících postupů. Tyto barvící postupy nám umožňují rozpoznat jednotlivé chromozomy, přesně stanovit jejich počet a určit změny v jejich struktuře (numerické a strukturální anomálie chromozomů). Konvenčním, homogenním barvením se zabarví celé chromozomy, G- a R- proužkovací metodou se vytvoří systém světlých a tmavých proužků, přičemž R-proužky se jeví jako negativ G-proužků. C-proužkováním se barví oblast centromer všech chromozomů a heterochromatinové části některých chromozomů. Další, méně často používané barvící metody nám umožňují řešit některé specifické situace.
Soubor chromozomů jedince nebo buňky uspořádaných podle mezinárodní cytogenetické klasifikace se nazývá karyotyp.
Cytogenetické vyšetření
Cytogenetické vyšetření karyotypu je náročný proces, vyžadující práci týmu specializovaných pracovníků (obr. 5 - pravá část). Po odběru periferní krve (ze žíly) se biologický materiál dostane do cytogenetické laboratoře. Zde se buňky kultivují 3 dny ve speciálním médiu – tekutém prostředí, obsahujícím všechny výživné látky potřebné pro růst a dělení buněk. Po uplynutí 72-hodin trvající kultivace se k buňkám přidává látka, jejímž působením se buněčné dělení zastaví ve stádiu metafáze, příp. prometafáze. Následným působením hypotonického roztoku buňky prasknou a odstraní se cytoplazma. Po fixaci se buněčná suspenze nakape na podložní sklíčko a po zaschnutí se obarví některou z barvících metod, standardně G-proužkovací technikou. Nakonec se chromozómy mikroskopicky hodnotí a určí se karyotyp vyšetřované osoby.
Molekulárně-genetické vyšetření
Defekty genů – mutace – představují malé změny, které jsou nepostřehnutelné pod mikroskopem. Jejich přítomnost se vyšetřuje moderními molekulárně genetickými metodami (obr. 5 – levá část). Po odběru periferní krve se z krevních buněk izoluje DNA. Z ní se speciálním postupem – polymerázovou řetězovou reakcí (z angl. PCR – polymerase chain reaction) mnohonásobně zmnoží úsek DNA, který potřebujeme vyšetřit. V závislosti na typu diagnostikované mutace se uskuteční štěpení produktu PCR reakce enzymy – restrikčními endonukleázami, které rozštěpí specificky amplifikované fragmenty na 2 části. Následně se jednotlivé fragmenty separují v elektrickém poli na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu, který se zdokumentuje. Odečtením velikosti fragmentů pak určíme přítomnost normální a mutované alely.
(obr. 5) Schéma cytogenetického a molekulárně-genetického vyšetření
