Fluorescenční in situ hybridizace

Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) je kombinací cytogenetických a molekulárně genetických metod. Podstatou metody FISH je hybridizace - navázání DNA sondy k chromozomální DNA vyšetřovaného vzorku pacienta. Sonda představuje malý fragment DNA značený fluorescenčním barvivem, která se váže na specifické místo chromozomu.

V současnosti je komerčně dostupná široká paleta sond pro celé chromozomy nebo jejich části, centromery i mnohé geny. Jejich pomocí můžeme blíže určit numerické i strukturální změny chromozomů v různých typech buněk a tkáních, na chromozomech i v nedělících se buňkách. FISH metoda posunula kupředu cytogenetickou diagnostiku, protože umožnila nahlédnout až na submikroskopickou úroveň chromozomů – tj. zviditelnit malé chromozomální přestavby, které nejsou viditelné a hodnotitelné v mikroskopu při rutinní cytogenetické analýze.

Pomocí FISH metody můžeme odhalit nebo upřesnit drobné delece, duplikace, translokace, určit původ marker chromozomů (obr. 1, obr. 2) a diagnostikovat buněčné linie, které jsou v tkáni nebo krvi zastoupeny jen v malém procentu, např. malé mozaiky pohlavních chromozomů X a Y u osob s poruchami reprodukce (obr. 3). Fluorescenční in situ hybridizaci používáme i ke stanovení frekvence numerických změn chromozomů ve spermiích u mužů s těžkými poruchami spermatogeneze (vývoje pohlavních buněk) (obr. 4). Od letošního roku byla zavedena preimplantační genetická diagnostika chromozomálních anomálií, při které se také používá metoda FISH (obr. 5, viz blok PGD).

(obr. 1) Malý nadpočetní marker chromozom neznámého původu, nalezen u ženy s mnohaletou primární sterilitou (horní obr.). Původ marker chromozomu byl určen metodou FISH s centromerickou sondou pro chromozom 15 (zelený signál) a sondami specifickými pro dva geny na dlouhém rameni téhož chromozomu. Na normálních chromozomech 15 jsou přítomny jeden zelený signál (centromera 15) a oba dva geny (červené signály), marker chromozom obsahuje dle FISH nálezu jen centromeru a nenese geneticky aktivní chromatin. Jeho přítomnost v karyotypu může souviset s neplodností vyšetřované ženy.

(obr. 2) Invertovaná duplikace chromozomu Y, který má současně deleci podstatné části dlouhého ramene, byla diagnostikována u muže s azoospermií (horní obr.). Zlom na dlouhém rameni chromozomu Y nastal pod centromerou v AZF oblasti, jejiž větší část chybí. Chromozomální anomálie byla upřesněna metodou FISH - hybridizací s genem SRY pro vývoj testes byla zjištěna invertovaná duplikace zlomeného chromozomu (2 červené signály označují přítomnost 2 kopií genu SRY) - obr. 2B. Molekulárně genetickými metodami byl upřesnen rozsah delece AZF oblasti.

(obr. 3) Mozaika pohlavního chromozomu X diagnostikovaná u pacientky s nepravidelnou menstruací. Červená značka – signál představuje centromeru chromozomu X; jeden červený signál znamená přítomnost jednoho chromozomu X v lini 45,X a dva červené signály znamenají přítomnost dvou chromozomů X v linii 46,XX.

(obr. 4) Vyšetření počtu chromozomů X, Y a 18 ve spermiích muže s těžkou formou oligospermie. Normální nález představuje přítomnost jednoho chromozomu X (zelený signál) a jednoho chromozomu 18 (modrý signál), anebo jednoho chromozomu Y (červený signál) a jednoho chromozomu 18 (modrý signál. Přítomnost dvou kopií chromozomů X spolu s jedným chromozomem 18, resp. dvou chromozomů 18 a jednoho chromozomu Y je patologickým nálezem.

(obr. 5) Blastomera z embrya, ze kterého by se vyvinul plod postižený Edwardsovým syndromem (jádro je podbarveno šedě, barevné značky jsou signály pro vyšetřované chromozomy: X – 2 fialové signály, 13 – 2 červené signály, 18 – 3 světle modré signály, 21 – 2 zelené signály).