Fluoreszente in situ Hybridisierung
Fluoreszente in situ Hybridisierung (FISH) ist eine Kombination aus zytogenetischen und molekulargenetischen Methoden. Die Grundlage der FISH-Methode ist Hybridisierung – die Verbindung der DNA Sonde mit der chromosomalen DNA einer untersuchten Probe. Die Sonde stellt ein kleines Fragment der DNA dar, das mit einem fluoreszierendem Farbstoff markiert wird, der sich an bestimmte Chromosomenabschnitte bindet.
Gegenwärtig gibt es Zugang zu einer breiten Palette von Sonden für ganze Chromosome oder deren Teile, Zentromere und viele Gene. Mit ihrer Hilfe können wir genauer die numerischen und strukturellen Chromosomenveränderungen in verschiedenen Zell- und Gewebetypen, bei Chromosomen und bei unteilbaren Zellen bestimmen. Die FISH-Methoe bedeutet für die zytogenetische Diagnostik einen großen Fortschritt, denn sie ermöglicht einen Einblick in die submikroskopische Ebene des Chromosoms, d.h. sie macht Teile des Chromosoms sichtbar, die so klein sind, dass sie bei der gängigen zytogenetischen Analyse unter einem Mikroskop nicht gesehen und ausgewertet werden können.
Mithilfe der FISH-Methode kann man kleine Deletionen, Duplikationen und Translokationen entdecken und genauer bestimmen, den Ursprung des Chromosomen-Markers (Abb. 1, Abb. 2) bestimmen und jene Zelllinien bestimmen, die in Gewebe und Blut nur in sehr kleinem Prozentsatz vorhanden sind, etwa kleine Mosaike der X- und Y-Geschlechtschromosomen bei Menschen mit Fruchtbarkeitsstörungen. (Abb. 3). FISH wir auch zur Bestimmung der Häufigkeit der chromosomalen Veränderungen in den Spermien bei Männern mit schweren Störungen der Spermatogenese angewandt (Abb. 4). Zu Beginn dieses Jahres wurde eine genetische Präimplantations-Diagnose für Chromosomen-Anomalien eingeführt, im Rahmen derer auch die FISH-Methode zur Anwendung kommt (Abb. 5, siehe Block PGD).
(Abb. 1) Ein kleiner überzähliger Marker unbekannter Herkunft, gefunden bei einer Frau mit jahrelanger primärer Sterilität (ober Abb.). Die Herkunft des Chromosomen-Markers wurde unter Anwendung der FISH-Methode mit einer zentromerischen Sonde für das Chromosom 15 (grünes Signal) und für zwei Gene spezifische Sonden auf dem langen Arm desselben Chromosoms entdeckt. Auf einem normalen Chromosom 15 befindet sich ein grünes Signal (Zentromer 15) und beide Gene (rote Signale), der Chromosomen-Marker besitzt laut FISH-Diagnose nur ein Zentomer und kein genetisch aktives Chromatin. Sein Auftreten im Karotyp kann mit der Unfruchtbarkeit der untersuchten Frau in Verbindung stehen.
(Abb. 2) – Ein kleiner überzähliger Marker unbekannter Herkunft, gefunden bei einer Frau mit jahrelanger primärer Sterilität (obere Abb.). Der Bruch aufd em langen Arm des Y-Chromosoms entstand unter dem Zentromer im AZF Abschnitt, der zum Großteil fehlt. Die Chromosomen-Anomalie wurde unter Anwendung der FISH-Methode präzisiert – durch die Hybridisierung des Gens SRY nach der Entwicklung des Tests wurde eine invertierte Duplikation des gebrochenen Chromosoms festgestellt (zwei rote Signale weisen auf die Anwesenheit von 2 Kopien des SRY-Gens hin) – Abb. 2B. Mit molekulargenetischen Methoden konnte das Ausmaß der Deletion im AZF Abschnitt genau definiert werden.
(Abb. 3) Ein bei einer Patientin mit unregelmäßiger Menstruation diagnostiziertes Mosaik von X-Geschlechtschromosomen. Das rote Signal stellt das Zentromer des X-Chromosoms dar; ein rotes Signal bedeutet die Anwesenheit eines X-Chromosoms in der Linie 45, X und zwei rote Signale bedeuten die Anwesenheit von zwei X-Chromosomen der Linie 46,XX.
(Abb. 4) Untersuchung der Zahl von X-, Y- und 18-Chromosomen bei einem Mann mit schwerer Oligospermie. Eine normale Diagnose bedeutet die Anwesenheit eines X-Chromosoms (grünes Signal) und eines Chromosoms 18 (blaues Signal) oder eines Y-Chromosoms (rotes Signal) und eines Chromosoms 18 (blaues Signal). Das Auftreten von zwei Kopien des X-Chromosoms gemeinsam mit einem Chromosom 18 bzw. zwei Chromosomen 18 und einem Y-Chromosom bedeuten einen pathologischen Befund.
(Abb. 5) Ein Blastomer aus einem Embryo, aus der sich ein Fötus mit Edwards-Syndrom entwickeln würde (der Kern ist grau eingefärbt, die Farbzeichen sind Signale für die untersuchten Chromosome: X – 2 violette Signale, 13 – 2 rote Signale, 18 – drei hellblaue Signale, 21 – 2 grün Signale)
